Estructura tridimensional (3-D) de JFH1 NS5B de tipo salvaje y mutante… | Descargar Diagrama Científico

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… de las células transfectadas con el tipo salvaje, demostrando que la reducción en la cantidad de núcleo secretado no se debía a una menor producción de esta proteína por parte del genoma quimérico. Dado que la p7 del VHC-A, al igual que la p7 del JFH1, tiene actividad de canal iónico (13), los resultados presentados anteriormente, en conjunto, sugieren que el defecto en la producción de virus infecciosos por parte del genoma quimérico se debió a la incompatibilidad entre la proteína p7 y las demás proteínas virales. se procesa de forma eficiente. El defecto en la producción de virus infecciosos podría deberse a una replicación insuficiente del genoma quimérico intergenotípico. El ARN restante tras la transfección no nos permitió medir la replicación del ARN directamente mediante técnicas estándar de RT-PCR cuantitativa. En su lugar, utilizamos los niveles de actividad de la luciferasa Renilla insertada en la unión p7-NS2 como medida sustitutiva de la replicación del ARN (Fig. 2A) (ver Materiales y Métodos) (19). Tras la transfección de las células HL1 con cantidades iguales de los transcritos quiméricos y de los de tipo salvaje, los niveles de actividad de la luciferasa intracelular fueron comparables en diferentes puntos tras la transfección (Fig. 2B). En este experimento, el transcrito de control Jc1-Luc, que codifica un gen de luciferasa en la unión p7- NS2, se replicó a niveles comparables a los de los transcritos de tipo salvaje y quimérico, pero la actividad de luciferasa de GND-Luc, que codifica una mutación letal en NS5B, disminuyó con el tiempo. El experimento descrito anteriormente estableció que los transcritos de tipo salvaje y los intergenotípicos se replicaban a niveles comparables y que el fracaso de la producción de virus infecciosos por parte del transcrito quimérico intergenotípico no se debía a un deterioro de la replicación del ARN. La poliproteína del VHC se procesa en varias proteínas maduras individuales de forma postraduccional. Las secuencias de aminoácidos que flanquean a p7 parecen afectar al corte de la proteína precursora E2-p7-NS2 (7). Por lo tanto, investigamos si la sustitución de JFH1 p7 por HCV-A p7 afectaba negativamente al procesamiento de la proteína precursora, lo que, a su vez, podría haber perjudicado la infectividad. El análisis de inmunoblot utilizando el MAb anti-E2 AP33 no reveló diferencias detectables en el procesamiento de las poliproteínas de tipo salvaje y quimérico (Fig. 2C). Además, también detectamos el núcleo y la NS5A, que se encuentran en los extremos opuestos de la poliproteína, y confirmamos además que la poliproteína quimérica se procesaba de forma eficiente (Fig. 2C). Estos datos sugieren que el deterioro de la producción de virus infecciosos tras la transfección de los genomas quiméricos en las células HL1 no se debió a un procesamiento groseramente incompleto de la poliproteína quimérica. Sin embargo, reconocemos la limitación de la sensibilidad del análisis de inmunoblot y, por tanto, no podemos descartar la posibilidad de que existan pequeñas diferencias en el procesamiento de las poliproteínas de tipo salvaje y quimérico. NS2 y NS5B. El defecto en la producción de virus por parte de los genomas JFH1 quiméricos sugiere que la compatibilidad de p7 y otras proteínas virales es crucial para el ensamblaje/maduración del virus. Además, la aparición de los virus revertientes tras el paso de las células que albergaban los genomas quiméricos indicaba la posible aparición de una(s) mutación(es) compensatoria(s) en los genomas defectuosos que suprimía(n) el defecto de ensamblaje y restablecía(n) su infectividad. Para identificar mutaciones puntuales en los genomas de los virus quiméricos, se prepararon stocks virales infectando células HL1 con sobrenadantes de los pasajes 4 y 2 de JFH1 de tipo salvaje y JFH1-J4p7, respectivamente. Las células infectadas se pasaron una vez, y sus fluidos sobrenadantes se filtraron y se utilizaron como reservas virales. Para determinar las secuencias de nucleótidos de JFH1 y de las quimeras, se amplificaron por RT-PCR las regiones codificantes completas de los genomas de tipo salvaje y quimérico en siete fragmentos superpuestos y se secuenciaron. La alineación de las secuencias de nucleótidos del virus recuperado con el genoma parental reveló mutaciones en dos posiciones, 2847 y 8118, que dieron lugar a dos cambios de aminoácidos en dos proteínas virales, NS2 y NS5B, respectivamente. La mutación en la posición 2847 (C2847A) dio lugar a la sustitución de un residuo de treonina en la posición 836 de la poliproteína (posición 23 en la NS2 de JFH1) por una asparagina en la putativa TM1 de la NS2. El residuo 23 de la NS2 está muy conservado entre los GT2, GT5 y GT6 (http: //euhcvdb.ibcp.fr/euHCVdb/), con una mutación conservadora a serina en los GT1, GT3 y GT4. Además de la mutación en NS2, se observó una mutación no sinónima en la posición 8118 (A8118G), que dio lugar a la sustitución de la lisina en la posición 2593 de la poliproteína (posición 151 en JFH1 NS5B) por un residuo de arginina. Tanto la arginina como la lisina tienen cadenas laterales con carga positiva, pero el grupo guanidio de la arginina es planar y puede participar en una variedad de interacciones de apilamiento. El residuo K151 del NS5B está muy conservado entre todos los genotipos del VHC. Es uno de los residuos que recubren el túnel NTP y, junto con seis aminoácidos adyacentes (posiciones 147 a 153), forma el bucle ⌳ 2 en la entrada del túnel NTP (5, 44) (Fig. 3). La modelización sugiere que la mutación K151R no produce alteraciones significativas en la estructura global de la proteína. genomas quiméricos defectuosos. Los resultados de la secuenciación sugieren que las mutaciones puntuales en NS2 y NS5B podrían haber corregido la incompatibilidad entre estas proteínas y la p7 mutante del VHC-A. Recientemente, hemos demostrado que la mutación C2847A en NS2 era suficiente para restaurar la infectividad de un genoma quimérico que codifica el VHC-A p7 de tipo salvaje (H. Gouklani et al., enviado para su publicación). Para investigar los efectos de las mutaciones identificadas en el restablecimiento de la infectividad de los genomas quiméricos, se transfectaron ARN de JFH1, JFH1-J4p7 parental, T23N-J (J se refiere a JFH1-J4p7), T23N-W (W se refiere a JFH1 de tipo salvaje), K151R-W, K151R-J, T23N/K151R-W y T23N/K151R-J en células HL1. A las 48 h después de la infección, los fluidos del sobrenadante del cultivo de las células transfectadas se utilizaron para infectar células HL1 naïve. La IF anti-NS5A reveló que ambas mutaciones por sí mismas restablecían la infectividad de los genomas no viables (Fig. 4). Ninguna de las mutaciones aumentó la infectividad respecto a la del virus de tipo salvaje. Para investigar el papel funcional de las mutaciones, medimos la infectividad intracelular y mostramos una correlación directa entre la infectividad intracelular y extracelular para el tipo salvaje y el mutante NS2 (Fig. 4). Curiosamente, el mutante que contiene la mutación NS5B reveló una infectividad intracelular similar a la del tipo salvaje, pero una infectividad extracelular 10 veces menor que la del tipo salvaje. Esto sugiere que la mutación NS5B por sí sola no corrigió eficazmente el defecto de ensamblaje y secreción del virus. Una explicación alternativa sería que la infectividad intracelular no alcanzó un nivel de umbral que permitiera la secreción del virus. Publicaciones recientes indican que p7 y NS2 interactúan físicamente y que esta interacción es crítica para la producción del virus (18, 26, 39). También se han notificado interacciones entre genotipos de p7 y NS2 (39). También hemos demostrado recientemente que la p7 del VHC-A y la NS2 del JFH1 se colocalizan en compartimentos celulares (Gouklani et al., presentado). Tras la determinación de las interacciones genéticas entre p7 y NS5B (véase más arriba), investigamos si estas dos proteínas se colocalizaban en las células como prerrequisito para sus interacciones genéticas y funcionales. Para ello, se expresaron transitoriamente p7-Flag y myc-NS5B en células Huh7.5. JFH1 p7-Flag y JFH1 myc-NS5B se colocalizaron en un patrón similar al de ER que era particularmente evidente en la región perinuclear (Fig. 5). También demostramos que el VHC-A p7-Flag y JFH1 myc-NS5B se colocalizaron en el mismo patrón que el observado para JFH1 p7 y NS5B. Aunque no observamos ninguna alteración en la colocalización de NS5B y p7, probamos además si JFH1 NS5B K151R tenía un impacto en la colocalización de p7 y NS5B. Este último experimento demostró que la mutación K151R en NS5B no afectaba al patrón de colocalización de p7 y NS5B, aunque el mutante NS5B, en comparación con el tipo salvaje, aparecía como puntos distintos (Fig. 5). Las mutaciones puntuales no alteraron la replicación del ARN. El rescate de genomas quiméricos no viables mediante mutaciones puntuales en NS2 y NS5B podría deberse a la mejora de la replicación del ARN viral. Por lo tanto, investigamos si la introducción de mutaciones puntuales tenía un impacto en la replicación del ARN. Para ello, se midió la actividad de la luciferasa Renilla como marcador sustitutivo de la replicación del ARN viral, tal y como se describe en Materiales y Métodos. Tras la transfección de las mismas cantidades de los respectivos transcritos en las células HL1 (por triplicado para cada transcrito), se midió la actividad de la luciferasa intracelular a las 24, 48 y 72 horas después de la transfección. Como puede verse en la Fig. 6, los mutantes que codifican las mutaciones NS2 T23N y NS5B K151R se replicaron de forma eficiente, y no observamos una diferencia notable entre la replicación de los genomas quiméricos parentales y la de los genomas que llevan mutaciones en NS2 y NS5B. El transcrito Jc1-Luc, que se utilizó como control positivo, también produjo niveles de actividad luciferasa comparables a los del tipo salvaje y a los transcritos quiméricos que codificaban mutaciones puntuales (Fig. 6). Sin embargo, cuando las células se transfectaron con GND-Luc, que es defectuoso en la replicación, se observaron niveles significativamente más bajos de actividad de luciferasa. Este experimento sugirió que las mutaciones puntuales individuales no tenían ningún efecto sobre la replicación del ARN viral y que el rescate del transcrito intergenotípico no viable no se debía a un aumento de la replicación del ARN. Se ha informado de que varias proteínas NS del VHC desempeñan un papel en el ensamblaje del virus (32). En este estudio, demostramos que la mutación K151R de la NS5B rescataba el virus defectuoso en su ensamblaje, mientras que no alteraba la replicación del genoma viral. Para investigar más a fondo los efectos de K151R en la actividad de la polimerasa NS5B, se utilizó un sistema in vitro como …

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