Ruolo dinamico del CSF1R nucleare nel lignaggio monocitico

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Tipo, i recettori con attività tirosin-chinasica (RTKs) sono glicoproteine transmembrana che, in risposta al legame del ligando, inducono segnali intracellulari che stimolano la proliferazione, il differenziamento e altre funzioni cellulari. Negli esseri umani, ci sono 58 RTK classificate in 20 sottofamiglie. Questi recettori sono più spesso costituiti da una porzione extracellulare a cui si lega un ligando, un dominio juxta-membrana con un ruolo regolatore, un dominio che porta attività chinasica e una regione C-terminale. Il legame del ligando induce la dimerizzazione del recettore e attiva la sua funzione di chinasi attraverso l’auto-fosforilazione o la trans-fosforilazione del dominio citoplasmatico. Questa fosforilazione e questo cambiamento conformazionale permettono il reclutamento di proteine (chinasi, fosfatasi, proteine adattatrici, ecc.) coinvolte nella segnalazione intracellulare. Per interrompere questa attività enzimatica, la cellula internalizza il recettore e lo degrada, di solito nei suoi lisosomi, o lo ricicla nella membrana plasmatica dopo averlo inattivato.

Molti di questi recettori sono anche localizzati nel nucleo (in inglese, membrane receptor in nucleus, o MRIN). Le MRIN sono state infatti identificate in 12 delle 20 sottofamiglie RTK. Sono presenti nel nucleo in forma intera (olorecettore) o come molecola troncata. Sono coinvolti nella regolazione trascrizionale e nella riparazione del DNA. CSF1R (recettore del fattore stimolante le colonie 1) o M-CSFR (recettore del fattore stimolante le colonie dei macrofagi) sono MRIN. Il CSF1R svolge un ruolo essenziale nel lineage dei monociti e dei macrofagi. I suoi ligandi sono il CSF1 e l’interleuchina-34 (IL-34). È anormalmente espresso dalle cellule di molte linee di cancro di origine epiteliale. È una RTK di classe III con due domini di attività chinasica separati da un dominio KI (kinase insert). Questa struttura è caratteristica di una famiglia che comprende anche PDGF-R (recettore del fattore di crescita derivato dalle piastrine), KIT/SCFR (recettore del fattore di crescita delle cellule staminali) e FLT3 (tirosin-chinasi 3 simile a Fms). Solo PDGF-R e CSF1R sono stati rilevati nel nucleo. Il CSF1R è stato osservato per la prima volta nel nucleo dei macrofagi murini e nelle cellule tumorali umane. Questa localizzazione nucleare è stata attribuita all’isoforma p110d della fosfoinositide 3-chinasi (PI3K) e alla GTPasi Rab5. Nel nucleo, CSF1R ha dimostrato di fosforilare le proteine p27 e Akt (o protein kinase B). Nelle cellule tumorali umane, CSF1R è stato anche rilevato sul promotore dei geni CCND1 (ciclina D1), MYC, JUN, e CSF1, suggerendo un ruolo nel controllo trascrizionale della proliferazione cellulare.

Combinando diverse forme di microscopia, abbiamo anche rilevato CSF1R nel nucleo dei monociti umani circolanti e in quello dei macrofagi derivati dal differenziamento di questi monociti in risposta a un ligando per CSF1R. È l’olorecettore che si trova nel nucleo di queste cellule e l’uso di un ligando fluorescente ha dimostrato che il recettore migra nel nucleo con il suo ligando. Questa traslocazione nucleare è bloccata da due inibitori di piccole molecole della funzione della chinasi CSF1R, BLZ945 e GW2580. Mediante immunoprecipitazione della cromatina seguita da sequenziamento (ChIP-seq), abbiamo rilevato 4.980 “picchi” CSF1R sul DNA di monociti di soggetti sani. Alcuni di questi picchi si trovavano sul promotore del gene PU.1/SPI1 (purine-rich nucleic acid-binding protein 1/ SFFV provirus integration site-1), che codifica un fattore di trascrizione per la differenziazione dei mielomonociti, e sul sito di inizio della trascrizione di CSF2RB, che codifica una delle catene del recettore GM-CSF (granulocyte monocyte-CSF). Più globalmente, i motivi del DNA dove sono stati rilevati i picchi di CSF1R corrispondono ai siti di legame dei fattori di trascrizione EGR (early growth response). ChIP-seq mirato a EGR1 ha mostrato la co-localizzazione dei picchi di CSF1R e EGR1, soprattutto nelle regioni intergeniche, con il marchio H3K4me1 (istone H3 mono-metilazione alla lisina 4). Abbiamo ripetuto questi esperimenti dopo aver esposto i monociti a CSF1, un ligando CSF1R, e osservato una rilocalizzazione di questo recettore ai siti di inizio della trascrizione già dalla sesta ora, un effetto che abbiamo anche osservato dopo 3 giorni di esposizione a CSF1 (Figura 1). CSF1R è quindi co-localizzato con il marchio H3K4me3 (tri-metilazione dell’istone H3 alla lisina 4). I motivi del DNA dove vengono rilevati i picchi di CSF1R corrispondono ai siti di legame dei fattori di trascrizione E2F4 (fattore di trascrizione E2F 4), ELK (fattore di trascrizione ETS) e YY1 (ying yang 1). Esperimenti di co-immunoprecipitazione hanno confermato l’interazione di CSF1R con ELK1 e YY1.

Figura 1. Figura 1.

Le interazioni del CSF1R con la cromatina differiscono nei monociti e nei macrofagi derivati dalla differenziazione di questi monociti. Nei monociti, CSF1R interagisce con EGR1, ed è co-localizzato con H3K4me1 nelle regioni intergeniche. Nei macrofagi, CSF1R interagisce con ELK1 o YY1, ed è co-localizzato con H3K4me3 nei siti di inizio trascrizione (TSS).

La leucemia mielomonocitica cronica è un’emopatia mieloide clonale associata all’età in cui i monociti si accumulano nel midollo osseo e nel sangue. L’espressione di CSF1R può essere diminuita nelle cellule del clone leucemico. Quando espresso, CSF1R è ancora rilevato sulla cromatina, ma in regioni distinte da quelle identificate nei monociti da soggetti sani.

La funzione di CSF1R non è quindi limitata all’induzione di segnali intracellulari dalla membrana plasmatica, ma coinvolge anche ruoli nucleari. Questo risultato può far luce su diversi aspetti della differenziazione mielomonocitaria normale e patologica. Per anni, l’impegno di una cellula staminale ematopoietica in un percorso di differenziazione è stato attribuito a variazioni stocastiche nell’equilibrio tra i fattori di trascrizione. Nel 2013, il team guidato da Michael Sieweke ha dimostrato che il CSF1 ha indotto l’espressione del gene PU.1, un potente regolatore del differenziamento mieloide, nelle cellule staminali ematopoietiche murine, suggerendo un effetto istruttivo dei fattori estrinseci sul loro differenziamento. La presenza di CSF1R nel nucleo delle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche suggerisce che questo effetto istruttivo può essere esercitato anche sul DNA. La forma nucleare di CSF1R può anche contribuire all’eterogeneità dei monociti circolanti. Negli ultimi dieci anni, una nomenclatura internazionale ha distinto tre popolazioni di monociti secondo il livello di espressione dei geni CD14 e CD16 (cluster di differenziazione 14 e 16): i monociti classici (CD14++/CD16-), intermedi (CD14++/CD16++) e non classici (CD14-/CD16++) costituiscono circa l’85%, il 5% e il 10% dei monociti circolanti, rispettivamente. I meccanismi alla base di questa eterogeneità rimangono controversi, ma almeno una parte dei monociti intermedi e non classici sono derivati dai monociti classici. I meccanismi molecolari di questa conversione, ancora imperfettamente compresi, coinvolgono in particolare un asse miR150/TET3 (microRNA150 / metilcitosina diossigenasi 3), deregolato da un meccanismo epigenetico nella leucemia mielomonocitica cronica. Anche il CSF1R è coinvolto in questa conversione poiché nella leucodistrofia diffusa ereditaria con sferoidi assonali, una rara microgliopatia dovuta a mutazioni inattivanti costitutive nel dominio tirosin-chinasico del CSF1R, c’è una diminuzione del numero di monociti intermedi e non classici. Inoltre, un anticorpo che blocca il CSF1R usato nel trattamento dell’artrite reumatoide provoca una deplezione dei monociti non classici. Resta da determinare se le funzioni nucleari di CSF1R giocano un ruolo nella conversione di un monocita classico in un monocita non classico, e se l’interruzione di queste funzioni osservata nella leucemia mielomonocitica cronica contribuisce anche alla distribuzione anomala delle popolazioni di monociti caratteristica di questa malattia.

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