Struttura tridimensionale (3-D) di JFH1 NS5B wild-type e mutante… | Download Scientific Diagram

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… delle cellule trasfettate con il tipo selvaggio, dimostrando che la riduzione della quantità di nucleo secreto non era dovuta alla minore produzione di questa proteina da parte del genoma chimerico. Poiché HCV-A p7, come JFH1 p7, ha attività di canale ionico (13), i risultati presentati sopra, presi insieme, hanno suggerito che il difetto nella produzione di virus infettivi da parte del genoma chimerico era dovuto all’incompatibilità tra p7 e le altre proteine virali. Il difetto nella produzione di virus infettivi potrebbe essere dovuto a un’insufficiente replicazione del genoma chimerico intergenotipico. L’RNA rimanente dopo la trasfezione non ci ha permesso di misurare direttamente la replicazione dell’RNA usando tecniche quantitative standard di RT-PCR. Invece, abbiamo usato i livelli di attività della luciferasi Renilla inserita nella giunzione p7-NS2 come misura surrogata della replicazione dell’RNA (Fig. 2A) (vedi Materiali e metodi) (19). Dopo la trasfezione di cellule HL1 con quantità uguali di trascrizioni chimeriche e wild-type, i livelli di attività intracellulare luciferasi erano comparabili in punti diversi post-trasfezione (Fig. 2B). In questo esperimento, il trascritto di controllo Jc1-Luc, che codifica un gene luciferasi alla giunzione p7- NS2, si è replicato a livelli comparabili a quelli dei trascritti wild-type e chimerici, ma l’attività luciferasi di GND-Luc, che codifica una mutazione letale in NS5B, è diminuita nel tempo. L’esperimento sopra descritto ha stabilito che i trascritti wild-type e intergenotipici si sono replicati a livelli comparabili e che il fallimento della produzione di virus infettivo da parte del trascritto chimerico intergenotipico non era dovuto al deterioramento della replicazione dell’RNA. La poliproteina dell’HCV viene elaborata in diverse singole proteine mature a livello post-traslazionale. Le sequenze aminoacidiche che fiancheggiano p7 sembrano influenzare la scissione della proteina precursore E2-p7-NS2 (7). Pertanto, abbiamo indagato se la sostituzione di JFH1 p7 con HCV-A p7 abbia influenzato negativamente il processamento della proteina precursore, il che, a sua volta, potrebbe aver compromesso l’infettività. L’analisi dell’immunoblot utilizzando il MAb anti-E2 AP33 non ha rivelato alcuna differenza rilevabile nell’elaborazione delle poliproteine wild-type e chimeriche (Fig. 2C). Inoltre, abbiamo anche rilevato il core e NS5A, che si trovano alle estremità opposte della poliproteina, e abbiamo ulteriormente confermato che la poliproteina chimerica è stata elaborata in modo efficiente (Fig. 2C). Questi dati suggeriscono che l’impedimento della produzione di virus infettivi dopo la trasfezione dei genomi chimerici nelle cellule HL1 non era dovuto a un’elaborazione grossolanamente incompleta della poliproteina chimerica. Tuttavia, siamo consapevoli della limitazione della sensibilità dell’analisi immunoblot e quindi non possiamo escludere la possibilità di differenze minori nell’elaborazione delle poliproteine wild-type e chimeriche. NS2 e NS5B. Il difetto nella produzione del virus da parte dei genomi chimerici JFH1 suggerisce che la compatibilità di p7 e di altre proteine virali è cruciale per l’assemblaggio/maturazione del virus. Inoltre, l’emergere dei virus revertanti dopo il passaggio delle cellule con i genomi chimerici ha indicato il possibile emergere di una mutazione compensatoria nei genomi difettosi che ha sovrastampato il difetto di assemblaggio e ripristinato la loro infettività. Per identificare mutazioni puntiformi nei genomi dei virus chimerici, sono stati preparati stock virali infettando cellule HL1 con surnatanti da passaggi 4 e 2 di JFH1 wild-type e JFH1-J4p7, rispettivamente. Le cellule infettate sono state fatte passare una volta, e i loro liquidi surnatanti sono stati filtrati e sono stati usati come stock virali. Per determinare le sequenze nucleotidiche di JFH1 e delle chimere, le intere regioni codificanti dei genomi wild-type e chimerici sono state amplificate da RT-PCR in sette frammenti sovrapposti e sono state sequenziate. L’allineamento delle sequenze nucleotidiche del virus recuperato con il genoma parentale ha rivelato mutazioni in due posizioni, 2847 e 8118, che hanno portato a due cambiamenti di aminoacidi in due proteine virali, NS2 e NS5B, rispettivamente. La mutazione in posizione 2847 (C2847A) ha portato alla sostituzione di un residuo tre-nove in posizione 836 nella poliproteina (posizione 23 in JFH1 NS2) con un’asparagina nel TM1 putativo di NS2. Il residuo 23 di NS2 è altamente conservato tra GT2, GT5 e GT6 (http: //euhcvdb.ibcp.fr/euHCVdb/), con una mutazione conservativa in serina in GT1, GT3 e GT4. Oltre alla mutazione in NS2, è stata osservata una mutazione non sinonima in posizione 8118 (A8118G), con conseguente sostituzione della lisina in posizione 2593 nella poliproteina (posizione 151 in JFH1 NS5B) con un residuo di arginina. Sia l’arginina che la lisina hanno catene laterali caricate positivamente, ma il gruppo guanidio dell’arginina è planare e può partecipare ad una varietà di interazioni di stacking. Il residuo K151 in NS5B è altamente conservato tra tutti i genotipi dell’HCV. È uno dei residui che rivestono il tunnel NTP e, insieme a sei aminoacidi adiacenti (posizioni da 147 a 153), forma il loop ⌳ 2 all’ingresso del tunnel NTP (5, 44) (Fig. 3). La modellazione suggerisce che la mutazione K151R non provoca alterazioni significative nella struttura generale della proteina. genomi chimerici difettosi. I risultati del sequenziamento hanno suggerito che mutazioni puntiformi in NS2 e NS5B avrebbero potuto correggere l’incompatibilità tra queste proteine e il mutante HCV-A p7. Recentemente, abbiamo dimostrato che la mutazione C2847A in NS2 era sufficiente per il ripristino dell’infettività di un genoma chimerico che codifica per HCV-A p7 wild-type (H. Gouklani et al., presentato per la pubblicazione). Per studiare gli effetti delle mutazioni identificate sul ripristino dell’infettività dei genomi chimerici, gli RNA di JFH1, JFH1-J4p7 parentale, T23N-J (J si riferisce a JFH1-J4p7), T23N-W (W si riferisce a JFH1 wild-type), K151R-W, K151R-J, T23N/K151R-W, e T23N/K151R-J sono stati trasfettati in cellule HL1. A 48 ore dopo l’infezione, i liquidi del surnatante delle cellule trasfettate sono stati usati per infettare le cellule HL1 ingenue. L’IF anti-NS5A ha rivelato che entrambe le mutazioni di per sé hanno ripristinato l’infettività dei genomi non vitali (Fig. 4). Nessuna delle mutazioni ha aumentato l’infettività rispetto a quella del virus wild-type. Per indagare i ruoli funzionali delle mutazioni, abbiamo misurato l’infettività intracellulare e abbiamo mostrato una correlazione diretta tra l’infettività intracellulare ed extracellulare per il tipo selvaggio e il mutante NS2 (Fig. 4). È interessante notare che il mutante contenente la mutazione NS5B ha rivelato un’infettività intracellulare simile a quella del tipo selvaggio ma un’infettività extracellulare 10 volte inferiore a quella del tipo selvaggio. Questo suggerisce che la mutazione NS5B da sola non ha corretto efficacemente il difetto di assemblaggio e secrezione del virus. Una spiegazione alternativa potrebbe essere che l’infettività intracellulare non ha raggiunto un livello di soglia che permette la secrezione del virus. Pubblicazioni recenti indicano che p7 e NS2 interagiscono fisicamente e che questa interazione è critica per la produzione del virus (18, 26, 39). Sono state riportate anche interazioni tra i genotipi di p7 e NS2 (39). Abbiamo anche dimostrato recentemente che HCV-A p7 e JFH1 NS2 colocalizzano nei compartimenti cellulari (Gouklani et al., presentato). In seguito alla determinazione delle interazioni genetiche tra p7 e NS5B (vedi sopra), abbiamo studiato se queste due proteine colocalizzassero nelle cellule come prerequisito per le loro interazioni genetiche e funzionali. A questo scopo, p7-Flag e myc-NS5B sono stati espressi transitoriamente in cellule Huh7.5. JFH1 p7-Flag e JFH1 myc-NS5B si sono colocalizzati in un modello simile all’ER che era particolarmente evidente nella regione perinucleare (Fig. 5). Abbiamo anche dimostrato che HCV-A p7-Flag e JFH1 myc-NS5B sono colocalizzati nello stesso schema di quello osservato per JFH1 p7 e NS5B. Anche se non abbiamo osservato alcuna alterazione nella colocalizzazione di NS5B e p7, abbiamo ulteriormente testato se JFH1 NS5B K151R aveva un impatto sulla colocalizzazione di p7 e NS5B. Quest’ultimo esperimento ha dimostrato che la mutazione K151R in NS5B non ha influenzato il modello di colocalizzazione di p7 e NS5B, anche se il mutante NS5B, rispetto al tipo selvaggio, è apparso come punti distinti (Fig. 5). Le mutazioni a punto singolo non hanno alterato la replicazione dell’RNA. Il salvataggio di genomi chimerici non vitali da mutazioni a punto singolo in NS2 e NS5B potrebbe essere dovuto al miglioramento della replicazione dell’RNA virale. Pertanto, abbiamo studiato se l’introduzione di mutazioni puntiformi avesse un impatto sulla replicazione dell’RNA. A questo scopo, l’attività della luciferasi Renilla è stata misurata come un marker surrogato per la replicazione dell’RNA virale, come descritto in Materiali e Metodi. Dopo la trasfezione delle stesse quantità dei rispettivi trascritti nelle cellule HL1 (in triplicato per ogni trascrizione), l’attività luciferasica intracellulare è stata misurata a 24, 48 e 72 ore dopo la trasfezione. Come si può vedere dalla Fig. 6, i mutanti che codificano le mutazioni NS2 T23N e NS5B K151R si sono replicati in modo efficiente, e non abbiamo osservato una notevole differenza tra la replicazione dei genomi chimerici parentali e quella dei genomi che portano mutazioni in NS2 e NS5B. La trascrizione Jc1-Luc, che è stata usata come controllo positivo, ha prodotto anche livelli di attività luciferasica comparabili a quelli del tipo selvaggio e delle trascrizioni chimeriche che codificano le mutazioni puntiformi (Fig. 6). Tuttavia, quando le cellule sono state trasfettate con GND-Luc, che è difettoso di replicazione, sono stati osservati livelli significativamente più bassi di attività luciferasica. Questo esperimento ha suggerito che le singole mutazioni puntiformi non avevano alcun effetto sulla replicazione dell’RNA virale e che il salvataggio del trascritto intergenotipico non vitale non era dovuto a un aumento della replicazione dell’RNA. È stato riportato che diverse proteine NS dell’HCV hanno un ruolo nell’assemblaggio del virus (32). In questo studio, abbiamo dimostrato che la mutazione NS5B K151R ha salvato il virus con difetti di assemblaggio, mentre non ha alterato la replicazione del genoma virale. Per indagare ulteriormente gli effetti di K151R sull’attività della polimerasi NS5B, è stato utilizzato un sistema in vitro come …

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