Estrutura tridimensional (3-D) de tipo selvagem e mutante JFH1 NS5B… | Download Scientific Diagram

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… de células transfectadas com o tipo selvagem, demonstrando que a redução da quantidade do núcleo secretado não foi devida a uma menor produção desta proteína pelo genoma quimérico. Como o HCV-A p7, tal como o JFH1 p7, tem actividade do canal iónico (13), os resultados apresentados acima, no seu conjunto, sugerem que o defeito na produção do vírus infeccioso pelo genoma quimérico se deveu à incompatibilidade entre a proteína p7 e as outras proteínas virais. O defeito na produção de vírus infecciosos pode ser devido a uma replicação insuficiente do genoma quimérico intergenotípico. O RNA remanescente após a transfecção não nos permitiu medir directamente a replicação do RNA, utilizando técnicas de RT-PCR quantitativas padrão. Em vez disso, utilizámos os níveis de actividade da luciferase de Renilla inserida na junção p7-NS2 como medida de substituição da replicação do RNA (Fig. 2A) (ver Materiais e Métodos) (19). Após a transfecção de células HL1 com quantidades iguais de transcrições quiméricas e do tipo selvagem, os níveis de actividade intracelular da luciferase foram comparáveis em pontos dif- ferentes pós-transfecção (Fig. 2B). Nesta experiência, a transcrição de controlo Jc1-Luc, codificando um gene luciferase na junção p7- NS2, replicada em níveis comparáveis aos das transcrições de tipo selvagem e quimérico, mas a actividade luciferase de GND-Luc, codificando uma mutação letal em NS5B, diminuiu ao longo do tempo. A experiência acima descrita estabeleceu que as transcrições de tipo selvagem e intergenotípicas replicadas a níveis comparáveis e que o fracasso da produção de vírus infecciosos pela transcrição quimérica intergenotípica não se deveu à deficiência da replicação do ARN. A poliproteína do HCV é processada em várias proteínas individuais maduras pós-tradução. As sequências de aminoácidos em flanco p7 parecem afectar a clivagem da proteína precursora E2-p7-NS2 (7). Portanto, investigámos se a substituição de JFH1 p7 pelo HCV-A p7 afectou negativamente o processamento da proteína precursora, o que, por sua vez, pode ter prejudicado a infecciosidade. A análise Immunoblot utilizando o anti-E2 MAb AP33 não revelou qualquer diferença detectável no processamento das poliproteínas de tipo selvagem e quiméricas (Fig. 2C). Além disso, também detectámos núcleo e NS5A, que se encontram em extremidades opostas da poliproteína, e confirmamos ainda que a poliproteína quimérica foi processada eficientemente (Fig. 2C). Estes dados sugerem que a diminuição da produção de vírus infecciosos após a transfecção dos genomas quiméricos em células HL1 não se deveu a um processamento grosseiro da poliproteína quimérica. No entanto, conhecemos a limitação na sensibilidade da análise de immunoblot e, portanto, não podemos excluir a possibilidade de pequenas diferenças no processamento das poliproteínas de tipo selvagem e quiméricas. NS2 e NS5B. O defeito na produção de vírus pelos genomas quiméricos JFH1 sugere que a compatibilidade da p7 e outras proteínas virais é crucial para a montagem/maturação do vírus. Além disso, o aparecimento dos vírus revertentes após a passagem das células danificam os genomas quiméricos, indicando a possível emergência de uma mutação(ões) compensatória(s) nos genomas defeituosos que sup- pressionaram o defeito de montagem e restabeleceram a sua infecciosidade. Para identificar mutações pontuais nos genomas dos vírus quiméricos, foram preparados stocks virais infectando células HL1 com sobrenadantes das passagens 4 e 2 do tipo selvagem JFH1 e JFH1-J4p7, respectivamente. As células infectadas passaram uma vez, e os seus fluidos sobrenadantes foram filtrados e utilizados como reservas virais. Para determinar as sequências nucleotídicas de JFH1 e as quimeras, todas as regiões codificadoras dos genomas do tipo selvagem e quimérico foram amplificadas por RT-PCR em sete fragmentos sobrepostos e foram sequenciadas. O alinhamento das sequências nucleotídicas do vírus de recobrimento com o genoma parental revelou mutações em duas posições, 2847 e 8118, que resultaram em duas alterações de aminoácidos em duas proteínas virais, NS2 e NS5B, respectivamente. A mutação na posição 2847 (C2847A) resultou na substituição de um resíduo de três – nove na posição 836 na poliproteína (posição 23 em JFH1 NS2) por uma asparagina no putativo NS2 TM1. O resíduo 23 de NS2 está altamente conservado entre GT2, GT5, e GT6 (http: //euhcvdb.ibcp.fr/euHCVdb/), com uma mutação conservadora para serina em GT1, GT3, e GT4. Para além da mutação em NS2, foi observada uma mutação não-sinónima na posição 8118 (A8118G), resultando na substituição da lisina na posição 2593 na poliproteína (posição 151 em JFH1 NS5B) por um resíduo de arginina. Tanto a arginina como a lisina têm cadeias laterais carregadas positivamente, mas o grupo guanidium da arginina é planar e pode participar numa variedade de interacções de empilhamento. O resíduo K151 em NS5B é altamente conservado entre todos os genótipos do HCV. É um dos resíduos que revestem o túnel do NTP e, juntamente com seis aminoácidos adjacentes (posições 147 a 153), forma um laço ⌳ 2 na entrada do túnel do NTP (5, 44) (Fig. 3). A modelação sugere que a mutação K151R não resulta em alterações significativas na estrutura global da proteína. genomas quiméricos defeituosos. Os resultados da sequência sugerem que as mutações pontuais em NS2 e NS5B poderiam ter corrigido a incompatibilidade entre estas proteínas e o HCV-A mutante p7. Recentemente, demonstrámos que a mutação C2847A em NS2 foi suficiente para a restauração da infecciosidade de um genoma quimérico que codifica o HCV-A p7 (H. Gouklani et al., submetido para publicação). Para investigar os efeitos das mutações identificadas na restauração da infecciosidade dos genomas quiméricos, RNAs de JFH1, parental JFH1-J4p7, T23N-J (J refere-se a JFH1-J4p7), T23N-W (W refere-se a JFH1 do tipo selvagem), K151R-W, K151R-J, T23N/K151R-W, e T23N/K151R-J foram transfectados em células HL1. Aos 48 h após a infecção, os fluidos sobrenadantes de cultura das células transfectadas foram utilizados para infectar células HL1 naïve. Anti-NS5A IF revelou que ambas as mutações por si só restabeleceram a infecciosidade dos genomas não viáveis (Fig. 4). Nenhuma das mutações aumentou a infecciosidade em relação à do vírus do tipo selvagem. Para investigar os papéis funcionais das mutações, medimos a infecciosidade intracelular e mostrámos uma correlação directa entre a infecciosidade intracelular e extracelular para o tipo selvagem e o mutante NS2 (Fig. 4). Curiosamente, a mutação contendo a mutação NS5B revelou uma infecciosidade intracelular semelhante à do tipo selvagem mas uma infecciosidade extracelular 10 vezes mais baixa do que a do tipo selvagem. Isto sugere que a mutação NS5B por si só não corrigiu eficazmente o defeito de montagem e secreção do vírus. Uma explicação alternativa seria que a infecciosidade intracelular não atingiu um nível limite que permita a secreção do vírus. partments. Publicações recentes indicam que p7 e NS2 interagem fisicamente e que esta interacção é crítica para a produção de vírus (18, 26, 39). Interacções entre genótipos de p7 e NS2 também foram relatadas (39). Também demonstrámos recentemente que o HCV-A p7 e o JFH1 NS2 colocam-se em compartimentos celulares (Gouklani et al., submetidos). Após a determinação das interacções genéticas entre p7 e NS5B (ver acima), investigámos se estas duas proteínas colocaram em células como um prereq- uisite pelas suas interacções genéticas e funcionais. Para este efeito, p7-Flag e myc-NS5B foram transitoriamente expressas em células Huh7.5. JFH1 p7-Flag e JFH1 myc-NS5B colocaram-se num padrão semelhante ao ER que era particularmente evidente na região perinuclear (Fig. 5). Também demonstrámos que o HCV-A p7-Flag e o JFH1 myc-NS5B colocaram no mesmo padrão que o observado para o JFH1 p7 e NS5B. Embora não tenhamos observado qualquer alteração na colocalização de NS5B e p7, testámos ainda mais se JFH1 NS5B K151R teve impacto na colocalização de p7 e NS5B. Esta última experiência demonstrou que a mutação K151R em NS5B não afectou o padrão de colocaliza-ção de p7 e NS5B, embora o mutante NS5B, com- paridade com o tipo selvagem, aparecesse como pontos distintos (Fig. 5). As mutações de ponto único não alteraram a replicação do RNA. O resgate de genomas quiméricos não viáveis por mutações de ponto único em NS2 e NS5B poderia ser devido ao melhoramento da replicação viral do RNA. Portanto, investigámos se a introdução de mutações pontuais teve um impacto na replicação do RNA. Para este efeito, a actividade da luciferase Renilla foi medida como um marcador substituto da replicação viral do RNA, tal como descrito em Materiais e Métodos. Após a transfecção das mesmas quantidades das respectivas transcrições em células HL1 (em triplicado para cada transcrição), a actividade intracelular da luciferase foi medida a 24, 48, e 72 h de pós-transfecção. Como se pode ver na Fig. 6, os mutantes que codificam as mutações NS2 T23N e NS5B K151R replicaram-se eficientemente, e não observámos uma diferença notável entre a replicação dos genomas quiméricos parentais e a dos genomas portadores de mutações em NS2 e NS5B. A transcrição Jc1-Luc, que foi utilizada como controlo positivo, também produziu níveis de actividade luciferase comparáveis aos do tipo selvagem e as transcrições quiméricas que codificam mutações pontuais (Fig. 6). Contudo, quando as células foram transfectadas com GND-Luc, que é uma replicação defeituosa, foram observados níveis significativamente mais baixos de actividade da luciferase. Esta experiência sugeriu que as mutações pontuais individuais não tiveram efeito na replicação do RNA viral e que o resgate da transcrição intergenotípica não viável não se deveu a um aumento da replicação do RNA. gesticulando um papel para NS5B na morfogénese do vírus. Várias proteínas do HCV NS foram reportadas como desempenhando um papel na montagem do vírus (32). Neste estudo, demonstrámos que a mutação NS5B K151R salvou o vírus defeituoso de montagem, enquanto que não alterou a replicação do genoma viral. Para investigar melhor os efeitos da K151R na actividade da polimerase NS5B, foi utilizado um sistema in vitro como …

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